人Ki67蛋白檢測試劑盒使用說明書
本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定人血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中Ki67蛋白的含量。
人Ki67蛋白檢測試劑盒實驗原理：
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人Ki67蛋白水平。用純化的人Ki67蛋白捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入人Ki67蛋白，再與HRP標記的檢測抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人Ki67蛋白呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人Ki67蛋白含量。
人Ki67蛋白檢測試劑盒組成：
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試劑盒組成
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48孔配置
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96孔配置
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保存
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說明書
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1份
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1份
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封板膜
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2片
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2片
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密封袋
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1個
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1個
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酶標包被板
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1×48
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1×96
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2-8℃保存
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標準品
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0.3ml×6管
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0.3ml×6管
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2-8℃保存
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酶標試劑
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5 ml×1瓶
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10 ml×1瓶
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2-8℃保存
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樣品稀釋液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑A液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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顯色劑B液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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終止液
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3 ml×1瓶
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6 ml×1瓶
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2-8℃保存
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20×濃縮洗滌液
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15ml×1瓶
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25ml×1瓶
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2-8℃保存
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注：標準品濃度依次為：2000、1000、500、250、125、0 pg/mL以此內推。
人Ki67蛋白檢測試劑盒樣本處理及要求：
1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
人Ki67蛋白檢測試劑盒操作步驟
1. 標準品的加樣：設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；。
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品*終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 加酶：每孔加入酶標試劑100μl，空白孔除外。
4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。
7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
9. 測定：以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。
人Ki67蛋白檢測試劑盒注意事項：
1． 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2． 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3． 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間*好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4． 請每次測定的同時做標準曲線，*好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大于標準品孔**孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請*后乘以總稀釋倍數（×n×5）。
5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6． 底物請避光保存。
7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9． 本試劑不同批號組分不得混用。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
（此圖僅供參考）
人Ki67蛋白檢測試劑盒計算：
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標， 在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
人Ki67蛋白檢測試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。
2.批內變異系數與批間變異系數應分別小于10%和15% 。
檢測范圍：請咨詢銷售人員
靈敏度：請咨詢銷售人員
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存： 2-8℃。
2．有效期： 6個月
